ATIVIDADES INSETICIDA, REPELENTE E ANTIFÚNGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cinnamomum cassia

11 de março de 2021

RESUMO

Devido ao uso indiscriminado de agentes químicos e as perdas de grãos armazenados, faz-se necessário a busca de novos compostos no controle dos insetos e fungos. Esse controle pode ser realizado pelo uso de inseticidas naturais. Neste sentido, o do presente trabalho foi avaliar o efeito repelente e inseticida do óleo essencial de Cinnamomum cassia no controle de Sitophilus zeamais, bem como sua atividade antifúngica sobre três fungos Aspergillus flavus, Alternaria alternata e Penicillium crustosum. A atividade de repelência foi determinada utilizando arenas de placas e mini silos interligados com substrato alimentar. Para o teste com as arenas de placas a repelência de C. cassia em S. zeamais ficou entre -0,7 e -0,6, respectivamente DL30 e DL15 e a dose de 0,34 µL/cm2 (52,86 µL/placa), a DL50, proporcionou o maior I.P. que foi de -0,9. Quanto aos mini silos, mostraram repelentes em todas as dosagens testadas, variaram entre -1,0 com 1582μL (DL50), –0,8 com 156,73μL (DL30), foi observada correlação (Pearson = 0,99) entre as diferentes doses testadas e os respectivos índices de preferência. Para a avaliação da atividade inseticida utilizou-se placas de Petry sem substrato alimentar. O óleo de C. cassia apresentou efeito inseticida alto, causando a mortalidade de 100% de S. zeamais, na concentração de 120μL/cm². Na concentrações menor, a mortalidade de insetos foi inferior a 22,5%. Os ensaios da atividade antifúngica foram realizados por meio da técnica de difusão em meio sólido utilizando cavidades em placa. O óleo essencial de C. cassia apresentou o valor de halo de inibição de 30 mm para A. alternata e P. crustosum e de 29 mm para A. flavus na maior concentração testada (10%). A partir dos resultados obtidos verificou que o óleo tem ação inseticida e ação de repelência sobre os S. zeamais, além disso, o óleo essencial é uma opção na inibição do desenvolvimento de fungos.

1. INTRODUÇÃO

O milho é a cultura mais amplamente difundida e cultivada, pois se adapta aos mais diferentes ecossistemas. O milho (Zeamays L.) é uma planta caracterizada por dois ciclos vegetativos, o ciclo cultivares precoce, com polinização 30 dias após a emergência e o ciclo normal, com abrangência máxima de 300 dias (CONAB, 2019). O milho, dentre os cereais, é uma das culturas mais cultivadas, sendo que em 2019 foramcom atualmente 183,73 milhões de hectares colhidos no mundo (USDA, 2019), sendo que o Brasil possui uma estimativa de área plantada de 18,2 milhões hectares, e uma produção com previsão de atingir, no ano de 2020 o volume de 251,8 milhões de toneladas, destacandose como um dos maiores produtores mundial de milho (CONAB, 2020). O constante crescimento da produção de milho está relacionado ao aumento da produtividade, sendo que as tecnologias desencadeiam papel fundamental para o crescimento da produção do milho (HERRENDORF; SCHOELLMAN, 2015). Entretanto, o sistema de produção brasileiro apresenta muitas perdas de grãos por pragas, que é um dos fatores mais importantes na crise alimentar global (HERNANDEZ et al., 2015). As pragas podem causar cerca de 5 a 10% de perda em grãos armazenados em países desenvolvidos e mais de 20% de perda de grãos nos países em desenvolvimento (GOLDEN et al., 2017). Com o uso eficiente de produtos agrícolas e reduzindo as perdas pré e pós-colheita, pode-se diminuir o dano de grãos (KUMAR et al., 2017). Entre as principais pragas estão os Coleoptera, popularmente conhecidos como besouros, dentro deste grupo, os gorgulhos ou carunchos possuem a capacidade de sobrevivem em grandes profundidades dos silos e graneleiros. Dentre as espécies mais encontradas estão: Rhyzopertha dominica, Sitophilus oryzae e Sitophilus zeamais (LORINI, 2018). As infestações de grãos por S. zeamais podem ocorrer tanto no campo, antes da colheita, quanto no armazenamento (WALE; ASSEGIE, 2015). Os fungos patógenos e deteriorantes são outra praga que podem provocar grandes perdas econômicas na comercialização de produtos vegetais (SHU et al., 2019). A contaminação por fungos afeta a qualidade dos grãos de milho pela produção de micotoxinas, que ocasionam danos à saúde, tanto humana quanto animal, em razão da atividade tóxica que podem exercer sobre o organismo (KUMAR et al., 2017). Quando consideramos a ocorrência mundial de fungos e sua capacidade produzir micotoxinas, os principais gêneros são Aspergillus, Penicillium, Fusarium e Alternaria (SHU et al., 2019). Para combater esses insetos e fungos encontrados em grãos armazenados, são aplicados indiscriminadamente agentes químicos. Os pesticidas são tóxicos por natureza e prejudiciais aos organismos vivos, podendo deixar resíduos tóxicos nos

alimentos e no ambiente, além do surgimento de insetos e fungos resistentes (MOSTAFALOU; ABDOLLAHI, 2017). Além disso, previsões estimam que a aplicação de pesticidas aumentará substancialmente nas próximas décadas (CARVALHO, 2017). Assim, os efeitos indesejáveis associados ao uso de pesticidas sintéticos têm levantado preocupação entre o público e pesquisadores buscando alternativas seguras e ecologicamente corretas, dentre elas o uso de óleos essenciais (AMOABENG; JOHNSON; GURR, 2019). O emprego dos óleos essenciais para o controle de insetos-pragas mostrou-se eficiente, por causa da sua complexidade e ao potencial de efeitos sinérgicos entre seus compostos podendo ser empregado na forma de pós, extratos e óleos. Ele possui a vantagem de diminuir o desenvolvimento de resistência dos insetos devido à mistura de compostos atuando em vários locais de ação, bem como, baixa persistência em condições de campo devido à alta volatilidade dos compostos e, portanto, menor toxicidade para organismos não-alvo (PEIXOTO et al., 2015; TAK; JOVEL; ISMAN, 2016). Mesmo que o Brasil tenha aumentado muito a produção de grãos e suas tecnologias nos últimos anos, pouco se avançou no controle de pragas em grãos armazenados. As perdas causadas por insetos e fungos ainda são muito altas, tanto perdas diretas na massa de grãos como indiretas na qualidade do produto. Assim, a possibilidade de inovação tecnológica para aplicação do óleo essencial de canela cássia (Cinnamomum cassia) no controle de pragas, surge como uma alternativa aos atuais métodos de controle utilizados, contribuindo para construção do conhecimento científico-tecnológico.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Avaliar a atividade repelente e inseticida do óleo essencial de canela cássia (Cinnamomum cassia) como forma de controle sobre o caruncho-do-milho (Sitophilus zeamais) em grãos armazenados, bem como a atividade antifúngica do óleo essencial sobre três fungos A. flavus, P. crustosum e A. alternata.

2.2. Objetivos específicos

- Avaliar a mortalidade de S. zeamais em diferentes concentrações do óleo essencial; - Determinar a concentração letal (DL50) do óleo essencial;

- Avaliar a atividade repelente do óleo essencial;

- Avaliar a atividade antifúngica do óleo essencial sobre A. flavus, P. crustosum e A. alternata.

3. REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 Produção de milho (Zeamays L.)

O milho é cultivado em quase todos os países, ocupando uma área de aproximadamente 160 milhões de hectares (SILVA et al., 2017). O Brasil se destaca na sua produção sendo uma das principais culturas produzidas no país, distribuída entre a primeira e segunda safra de 2020, atingiu 100,7 milhões de toneladas (CONAB, 2020). Em 2019, o Brasil, encontrava-se como 3º maior produtor de milho no mundo e 2º maior exportador, com um consumo diário elevado (CONAB, 2019). A produção de milho ocupa em todo o território nacional cerca de 12 milhões de hectares, concentrada nos estados de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, os quais respondem por cerca de 98% da produção nacional. Embora seja uma cultura apropriada ao uso de alta tecnologia e com potencial para produzir acima de 16 t/ha, predomina o uso de tecnologia de baixo investimento, o que tem mantido a produtividade média nacional em torno de 5,7 t/ ha (CONAB, 2019). No Brasil estima-se uma produção para a safra de 2027/28, de 113,2 milhões de toneladas, porém seu limite superior pode chegar a 139,7 milhões de toneladas. O acompanhamento da safra de grão aponta uma área plantada de milho tendo um acréscimo de 6,2% entre 2017/18 e 2027/28, passando de 16,6 milhões de hectares em 2017/18 para 17,7 milhões no final do período das projeções. Podendo chegar a 23,4 milhões de hectares nos próximos dez anos (BRASIL, 2018). Segundo técnicos que trabalham com essa cultura, o aumento da área deve ser superior ao que está sendo projetado e talvez se aproximar mais do seu limite superior de crescimento que é de 23,4 milhões de hectares (MAPA, 2018).Produção essa, que teve uma colheita recorde em 2016/17 (GASQUES; SOUZA; BASTOS, 2018). Seu crescimento resplandece índices com 4,67% a.a. na produção e 2,95% a.a. na produtividade (CONAB, 2018), dados maiores aos observados para o mundo e para os Estados Unidos (USDA, 2018). O milho ganhou destaque nos últimos anos alcançando o patamar de maior cultura agrícola do mundo, sendo a única a ter ultrapassado a marca de um bilhão de toneladas, ultrapassando concorrentes como o arroz e o trigo. O consumo interno brasileiro de milho que em 2017/18 representou 60,4% da produção, deve elevar-se nos próximos anos para 66,1% (MAPA, 2018). Fato que se deve a cultura ainda se notabilizar pelos diversos usos. Estimativas indicam para mais de 3.500 aplicações deste cereal, como ração, alimentos, combustíveis, entre outros. Além da sua importância no aspecto de segurança alimentar, na alimentação humana e animal. (MIRANDA, 2018).

São dois os destinos da produção brasileira de milho, o consumo no estabelecimento rural e o mercado consumidor, com fluxos de comercialização direcionados às fábricas de ração, indústrias químicas, produto in natura e exportação. A suinocultura e a avicultura são responsáveis pela utilização damaior parte dos grãos (41%), servindo como matéria-prima básica para a formulação de rações. O restante da produção divide-se entre a indústria (13,5%), formulação de rações para outras espécies animais (5,6%) e produção de sementes (0,6%) e 40 % dos grãos produzidos não são comercializados, devidoprincipalmente ao consumo na propriedade rural (24,7%), ao consumo humano nas grandes cidades (4,4 %) e às perdas durante a colheita e armazenamento (9,9%) (GOLDEN et al., 2018; MIRANDA, 2018).

3.2 Insetos-Praga

Os insetos são o grupo mais populoso do reino animal e formam um componente muito importante do ecossistema. Entretanto, alguns insetos são prejudiciais devido a transferência patógenos perigosos, além de causarem danos às culturas e aos alimentos armazenados (JANKOWSKA et al., 2019). Os insetos constituem o principal fator de perdas nos grãos durante o período de armazenagem (STEJSKAL et al., 2015). As perdas de grãos devido a ataques de insetos-pragas podem representar de 15 a 50% da produção total, dependendo da localização geográfica (CASINI; SANTAJULIA, 2015). Entre os fatores, a ação dos insetos-praga é um dos que mais afetam produtividade das lavouras de milho, devido a atacarem desde a semeadura até a colheita, causando danos nas raízes, colmos, folhas e espigas (HERNANDEZ et al., 2015). Os insetos são classificados quanto seu hábito alimentar em grupos sendo pragas primárias e secundárias. As primárias atacam grãos e sementes inteiros, dependendo da parte do grão que atacam, podem ser denominadas pragas primárias internas ou externas. As primárias internas perfuram os grãos e sementes e nestes penetram para completar seu desenvolvimento. Já as pragas primárias externas destroem a parte exterior do grão ou semente (casca) e, posteriormente, alimentam-se da parte interna sem, no entanto, se desenvolverem no interior destes. As pragas secundárias são aquelas que não conseguem atacar grãos e sementes sadias, pois não conseguem se alimentar de grãos inteiros, mas aproveitam para atacar grãos danificados por pragas primárias (LORINI, 2018). O Sitophilus zeamais Motschulsky (1885) (Curculionidae), é um inseto pequeno (2,5 mm a 4 mm), cuja fêmea causa danos aos grãos ao perfurá-los para oviposição. A prole (larvas) alimenta-se das partes internas do grão, reduzindo seu peso. Com a perda de peso, o dano causado pela alimentação do gorgulho leva a reduções severas nos valores nutritivos e

econômicos, reduzindo a viabilidade da semente, bem como causando contaminação por excreções e fragmentos de seus corpos (SULEIMAN et al., 2015; WEI et al., 2014). Trata-se de uma praga cujas larvas vivem exclusivamente no interior do grão e que os adultos podem atacar grãos tanto no campo quanto no armazém (infestação cruzada). Apresenta elevado potencial biótico, com média de 282 ovos por fêmea. O período médio de oviposição é de 104 dias e o período de incubação oscila entre 3 e 6 dias, o ciclo evolutivo de ovo até emergir o inseto adulto é em média de 34 dias. A postura é realizada na superfície dos grãos e as larvas, após se desenvolverem, empupam e se transformam em adultos ainda dentro do grão. Tanto os adultos quanto as larvas se alimentam do grão e os danos causados se refletem em perdas quantitativas e qualitativas (LORINI, 2015; BESPALHOK; RENESTO; SIGNORINI, 2015). Na Figura 1, encontra-se uma representação do S. zeamais, popular caruncho do milho.

3.3 Fungos e toxinas

As micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos, os quais estão presentes no solo, na água, ou são carregados pelo vento (esporos). Quando encontram as condições (tempo, temperatura e substrato) adequadas para sua multiplicação, desenvolvem-se exponencialmente e podem gerar as micotoxinas (VALMORBIDA, 2016). Se as condições forem favoráveis, a contaminação por fungos e micotoxinas pode ocorrer durante a fase de desenvolvimento das culturas, no campo, e continuar após a colheita, no armazenamento e após o processamento, sendo um risco em todos os setores envolvidos na produção de alimentos (OLDENBURG et al., 2017). As micotoxinas são estáveis ao calor e resistentes à maioria das condições de processamento, persistindo e sendo repassadas (ALIM et al., 2018; MARTINS et al., 2018; OUESLATI et al., 2018). As micotoxinas em grãos de milhosãoproduzidas principalmente pelos gêneros Aspergillus, Penicillium, Fusarium e Alternaria,sendo os mais importantes quando consideramos a ocorrência mundial de fungos e sua capacidade em produzir micotoxinas (SHU

et al., 2019). Enquanto as espécies de Aspergillus e Penicillium são geralmente encontradas como contaminantes nos alimentos durante a secagem e o armazenamento, Fusarium e Alternaria podem produzir micotoxinas antes ou imediatamente após a colheita (NGANGA, et al., 2016) O A. flavus é um fungo responsável pela deterioração de muitos alimentos, além disso, as cepas toxigênicas de A. flavus podem se desenvolver em nozes, amendoim, sementes de algodão, milho e outros cereais, produzindo micotoxinas carcinogênicas altamente tóxicas, as aflatoxinas (ALBUZAUDIet al., 2017).A espécie A. alternata é a mais toxigênica do gênero, podendo ser encontrada em produtos, como plantas, frutas, oleaginosas e cereais, bem como milho (JUAN-GARCIA et al., 2015). A espécie P. crustosumé uma das responsáveis pela deterioração de alimentos, sendo também relacionada à intoxicação animal devido ao consumo de cereais e rações contaminados (ZAHORANOVÁ et al., 2018). O controle natural da proliferação de fungos pode ser realizado por óleos essenciais de plantas e seus constituintes isolados, como Cinnamomum zeylanicume Eugenia caryophyllus (CASTRO et al., 2017), Cymbopogon martinii, Illiciumverum e Melaleuca alternifolia (NETO et al., 2019), Litseacubeba, C. cassia, C. martiniie Thymusmongolicus (WANG et al., 2018) e cinamaldeído (XU et al., 2018).

3.4 Controle dos insetos e fungos em grãos armazenados

O controle das pragas de grãos armazenados pode ser feito pelo método físico, químico ou biológico (LORINI, 2015). O controle físico é feito pelo controle da temperatura, umidade relativa do ar, teor de umidade dos grãos e dos silos, graneleiros e armazéns, além da pressão no produto. As estratégias de manejo com controle químico de pragas em grãos a granel incluem o uso de fumigantes ou expurgo, que são pulverizados diretamente nos produtos à medida que são carregados no armazenamento. Aerossóis e sprays de contato também são usados como tratamentos estruturais em empresas, plantas de processamento e armazéns de alimentos (WIJAYARATNE; ARTHUR; WHYARD, 2018). O controle biológico é feito empregando-se parasitas, predadores ou patógenos para eliminar as populações de insetos. O mesmo acontece quando a grande quantidade de uma praga de insetos é extinta pela ação de um inimigo natural vivo. O controle biológico natural ocorre na ausência de contribuição humana (MILLS, 2014). Apesar dos efeitos maléficos dos inseticidas sobreporem-se aos benéficos, esse método ainda continua sendo o mais utilizado de manejo de pragas contra insetos de produtos armazenados (VÉLEZ et al., 2017). A pulverização com inseticidas residuais é o principal método de controle preventivo contra insetos-pragas de armazéns, enquanto, os inseticidas protetores têm aplicação direta no grão, a qual se dá por aplicação de uma solução inseticida sobre os grãos (WIJAYARATNE; ARTHUR; WHYARD, 2018). O uso excessivo de inseticidas sintéticos pode propiciar a resistência em insetos-pragas. O motivo pela qual ocorre resistência nas populações de insetos é dependente do volume e frequência das aplicações dos inseticidas utilizados no manejo, além das capacidades inerentes das espécies de insetos também desempenham um papel significativo no desenvolvimento da resistência. Entre os fenômenos evolutivos, a resistência aos inseticidas é o de maior impacto econômico (NAQQASH et al., 2016). Devido os problemas causado pelos inseticidas sintéticos como os impactos ambientais e sanitários, observa-se uma evolução sobre a consciência ambiental, além de uma preocupação com os impactos à saúde (DING et al., 2015), impulsionando o interesse no desenvolvimento de novas alternativas para o controle de pragas por métodos menos danosos, com um nível razoável de segurança ecológica e humana (JANKOWSKA et al., 2019). Assim, a busca por sustentabilidade na agricultura está levando a mudança de agentes químicos por alternativas de menor risco, uma conversão que envolve frequentemente a implementação de inseticidas naturais, que são frequentemente referidos como bioinseticidas (CELESTINO et al., 2014).

3.5 Óleos essenciais

Óleos essenciais podem ser extraídos de diversas plantas e são ricos em compostos bioativos, que conferem a eles atividades biológicas (SOUZA et al., 2019). A designação do óleo essencial refere-se às suas características hidrofóbicas e sua similaridade com os óleos em termos de viscosidade. Pois, eles são lipofílicos, líquidos, normalmente menos densos que a água e são substâncias altamente odoríferas. Quanto, o termo essencial consiste na essência nativa e fragrância específica da planta da qual o óleo é extraído (RAUT; KARUPPAYIL, 2014). Os óleos essenciais e seus componentes tornaram-se objeto de crescente interesse na gestão integrada de pragas, sendo cada vez mais propostos como alternativa aos inseticidas sintéticos (PAVELA; BENELLI, 2016; ROMAN, 2016) Sabe-se que as plantas e especiarias aromáticas apresentam compostos ativos capazes de inibir o crescimento microbiano, podendo atuar como agentes antimicrobianos (SANTOS et al., 2017). Além do mais, a maioria das plantas aromáticas ricas em óleos essenciais tem potencial para funcionar como inseticidas e repelentes (JESSICA et al., 2017), pois possuem naturalmente capacidades bioativas contra inúmeros grupos de pragas, devido, em grande parte, ao seu desenvolvimento evolutivo, para própria defesa e em resposta a possíveis ataques (GONÇALVES; HUERTA; FREITAG, 2016). Porém ressalta-se que as plantas, podem atuar como sistemas atrativos e fazer a manutenção de inimigos naturais nas áreas cultivadas (RESENDE et al., 2015) Os componentes principais podem constituir até 85% dos óleos essenciais, enquanto outros componentes estão presentes apenas como traço. A composição e as propriedades físicoquímicas dos óleos essenciais são muito influenciadas pela espécie, parte da planta utilizada, origem geográfica, época da colheita, fase de desenvolvimento, idade das plantas e método de extração (RIBEIRO-SANTOS et al., 2015). A diferenciação da composição dos óleos essenciais de uma determinada espécie de planta, entre as épocas de colheita e fontes geográficas é decorrente, pelo menos em parte, da formação de substâncias antibacterianas a partir dos seus precursores. Wang et al. (2019) avaliaram os efeitos fumigante, toxicidade de contato e atividade repelente destas plantas ou gênero óleos essenciais (OE) de quatro plantas de especiarias da família Lauraceae, sendo elas Cinnamomum burmannii, Cinnamomum migao, Litsea pungens e Laurus nobilis sobre Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae; besouro de farinha vermelha) e Liposcelis bostrychophila (Psocoptera: Liposcelididae; booklice).

3.6 Cinnamomum cassia

O gênero Cinnamomum pertence à família Lauraceae e compreende cerca de 250 espécies.Esse grande número de espécies oferece abundantes matérias-primas, uma vez que as especiarias e plantas dessa família possuem atividades amplamente biológicas (WANG et al., 2019). A família Lauraceae se concentra principalmente na Ásia tropical e subtropical, na Austrália e nas ilhas Pacifica (WEI et al., 2017). É uma árvore de ciclo perene que atinge de 8 a 9 metros de altura. A obtenção da canela é obtida do tronco da caneleira, uma árvore que tem seus galhos secos separados de suas “cascas” de cor marrom avermelhadas, muito perfumadas (WANG et al., 2019). Devido às suas propriedades antimicrobiana, antioxidante e anticancerígena (WANG et al., 2019), C. cassia tem sido utilizada em alimentos, condimentos, cosméticos e medicamentos (UTCHARIYAKIAT et al., 2016). A FEMA (Flavor and Extract Manufacturers Association) considera os derivados de Cinnamomum, como os extratos e óleos essenciais, quando usados como ingredientes aromatizantes, como GRAS (geralmente reconhecidos como seguros) (RIETJENS et al., 2020). A Figura 2 apresenta uma imagem da árvore Cinnamomum (a) e das suas flores e folhas (b), e da C. cassia em paus (c).

O componente principal do óleo essencial de C. cassiaé o trans-cinamaldeído, representando cerca de 60 a 75% da composição total do óleo essencial (FIGUEIREDO et al., 2017). Uma maior concentração de trans-cinamaldeído é normalmente encontrada no óleo essencial destilado da casca do que da folha (DUSSAULT; VU; LACROIX, 2014). Foi relatado que trans-cinamaldeído possui propriedades antifúngicas estimulantes (ANDRADE-OCHOA, 2015; SUN, 2016). Xie et al. (2017), relataram que o tratamento de A. flavus com cinamaldeído mostrou uma diminuição na germinação de esporos, juntamente com alterações significativas na morfologia e na ultraestrutura de hifas e esporos. Ribeiro-Santos et al. (2017), avaliaram tanto a atividade antimicrobiana contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Penicillium spp, como a atividade antioxidante dos óleos essenciais de C. cassia (canela) e C. zeylanicum (canela). Na qual, esses estudos mostraram forte atividade antimicrobiana, sendo que o óleo essencial de C. cassia apresentoumaior eficiência na inibição do crescimento dos microrganismos testados e, seu composto principal, o cinamaldeído, mostrou o maior efeito antimicrobiano, seguido do eugenol. O óleo essencial de C. zeylanicum e seu composto principal, eugenol, mostraram a maior atividade antioxidante.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Manutenção da criação e reprodução e reprodução dos insetos

Os insetos Sitophilus zeamais utilizados nos experimentos foram obtidos em um silo da cidade de Tapejara - RS e foram mantidos no Laboratório de Biotecnologia da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões – Câmpus de Erechim em frascos de 1 litro com milho sob condições aproximadas de 25°C e umidade relativa de 75%. Para que ficassem estéreis, estando prontos para testes, os frascos com milho e insetos foram mantidos em freezer a – 80 ºC por um período de 24 horas. Para a realização dos bioensaios foram inoculados 20 insetos adultos em 20 frascos de 1L com milho, onde permaneceram durante 15 dias até a eclosão dos ovos. Após os 15 dias os insetos adultos foram retirados, procurando deixar nos vidros somente os ovos e ninfas. Estes insetos que vierem a eclodir foram utilizados para os experimentos seguintes, pois se encontrava na mesma faixa etária (PROCÓPIO et al., 2003). Sabe-se que em 15 dias esses insetos estariam prontos para eclosão dos ovos ou já em ninfa, devido a testes de observações realizados com os insetos.

4.2. Avaliação do efeito inseticida do óleo essencial de C. cassia

Para avaliação da atividade inseticida dos óleos essenciais, foram utilizadas placas circulares, conforme Figura 3, sendo que para este teste não foi usado substrato alimentar. Foram aplicadas diferentes concentrações (5, 10, 20, 30, 50, 100 e 120μL) de óleo em um papel filtro, e acrescentadas pérolas de vidro impedindo o contato direto do inseto com o óleo.

Foram utilizados no teste 20 insetos adultos, não sexados. Após a aplicação do óleo, as placas foram mantidas em ambiente sem luz e aclimatizado (20°C e U.R. 65%), para após 24 horas, contar o número de insetos mortos por placa (PROCÓPIO et al., 2003). Foi utilizado um delineamento experimental casualizado com seis repetições para cada concentração de óleo de canela cássia. A curva de mortalidade foi obtida pela correlação entre a dose e o percentual de insetos mortos, e as doses letais (DL15, DL30 e DL50) foram determinadas a partir da equação da curva gerada.

4.3 Avaliação do efeito repelente em placas do óleo essencial de C. cassia

Para a avaliação do efeito repelente, foi feita uma arena(Figura 4), com cinco placas plásticas circulares com 14,0 cm de diâmetro, 2,0 cm de altura e 153,9 cm2 , sendo a central interligada simetricamente com as demais por mangueiras plásticas, dispostas diagonalmente(PROCÓPIO et al., 2003).

Nos recipientes, exceto na placa central, colocou-se 20 g de grãos de milho. Na placa central, foram liberados 50 insetos adultos, não sexados, e após 24 horas foi feita a contagem. Antes dos experimentos os insetos ficaram por 3 horas sem contato com o substrato alimentar (TAVARES; VENDRAMIM, 2005). Utilizou-se o delineamento experimental casualizado, com três repetições. Em concomitante, nas duas placas em lados opostos foi testada a concentração determinada pelas doses letais calculadas pela avaliação inseticida sendo elas DL15, DL30, e DL50 e as outras duas placas ficaram como testemunhas (sem óleo essencial). Após 24 horas foi feita a contagem dos insetos presentes nas placas com o tratamento e nas placas testemunha.

4.4 Avaliação do efeito inseticida e repelente em mini silos do óleo essencial de Cinnamomum cassia

O ensaio foi realizado em um recipiente central circular, medindo 13,5 cm de altura por 9 cm de diâmetro (858,8 cm3 ) e os laterais colocados opostos simetricamente possuíam 6 cm de altura por 4,5 cm de largura (95,4 cm3 ). Os mini silos, conforme Fig. 5, foram preparados com 50g de milho em cada recipiente menos no central. Em dois recipientes laterais foi aplicado o óleo essencial (tratamento) sobre um papel filtro na parte superior e inferior dos simuladores de mini silos e nos outros dois não havia óleo essencial, sendo considerados testemunha.

A aplicação do óleo essencial em papel filtro colocado somente na parte superior e inferior dos silos simula uma aplicação l em condições normais de uso, garantido que o efeito seja apenas por fumigação e não aplicação direta do mesmo sobre os grãos armazenados. Os recipientesque simulam silos (mini silos) apresentam proporções métricas similares a silos graneleiros comerciais, buscando uma condição mais próxima da realidade. Nos ensaios foram usados 50 insetos adultos, não sexados, neste teste de mortalidade. As doses usadas para este teste foram 3000, 4000, 5000, 6000, 7500 e 9000μL ou 31,45, 41,93, 52,41, 62,89, 78,62 e 94,34 μL/cm3 . Após 24 horas contaram-se o número de insetos por mini silos. Antes dos experimentos os insetos ficaram por 3 horas sem contato com o substrato alimentar (TAVARES; VENDRAMIN, 2005). Em concomitante foram testados a ação de repelência, nos dois mini silos em lados opostos foram testados a concentração determinada pelas doses letais calculadas pela avaliação inseticida sendo elas DL30 e DL50 e os outros dois mini silos ficaram como testemunhas (sem óleo essencial). Após 24 horas foi feita a contagem dos insetos por mini silos com o tratamento e nos testemunha. É importante ressaltar que a testemunha dos experimentos não aparecerá nos resultados pelo fato de não influenciar na contagem dos insetos que estavam nos mesmos.

4.5. Avaliação do efeito antifúngico do óleo essencial de C. cassia

A atividade antifúngica do óleo essencial comercial de C. cassia (Ferquima) foi baseada na metodologia de Hadaceck e Greger (2000), com o método de difusão em meio sólido com cavidades em placa, sobre três fungos: Alternaria alternata, Aspergillus flavus e Penicillium crustosum, obtidos junto ao Agricultural Research Service (ARS Culture Collection - NRRL). Para os ensaios da atividade antifúngica, primeiramente realizou-se diferentes concentrações do óleo essencial comercial de C. cassia e do trans-cinamaldeído (10, 8, 5, 3, 1 e 0,5%; v/v) em água destilada estéril com 1% de Tween 80 e em seguida as diluições foram agitadas em agitador de tubos (Phoenix, AP 56) por 5 minutos antes da utilização. Após a esterilização do meio Potato Dextrose Agar (PDA) (Merck) o mesmo foi resfriado até aproximadamente 40 °C, temperatura em que ainda está líquido e não provoca a morte do micro-organismo, que é adicionado ao meio na proporção 1 mL de suspensão fúngica (aproximadamente 106 UFC.mL-1 ) para 20 mL de meio de cultura. Em seguida realizou-se o plaqueamento e após a solidificação do ágar, quatro cavidades foram feitas com cânulas de vidro estéreis com 6 mm de diâmetro, sendo então depositados 50 μL da solução com óleo essencial ou trans-cinamaldeído, 50 μL de Tween 80 (Dinâmica), utilizado como controle negativo, 50 μL de água estéril (controle negativo) e 50 μL de antifúngico comercial Canesten® (1% de clotrimazol) como controle positivo (Figura 6).

Em seguida, incubou-se o sistema por 72 h a 25 ºC em estufa (Tecnal, TE 392/2), sendo verificado a cada 24 h (LAUXEN, 2012). Os testes foram realizados em triplicata.

Logo após o crescimento do fungo, mediu-se o diâmetro total do halo, levando-se em consideração o diâmetro da cavidade (6 mm), e os resultados foram expressos em milímetros. A concentração inibitória mínima (CIM) foi considerada como a concentração de amostra capaz de desenvolver um halo de inibição do crescimento fúngico maior ou igual a 10 mm de diâmetro (LIMA et al., 2006). A comparação das médias para avaliar o efeito antifúngico foi realizada através do Teste de Tukey (p<0,05) com a utilização do programa SAS.

4.6 Análise estatística

A estimativa da DL50, DL30 e DL15, foi feita pela análise de Probit, utilizando o programa SPSS (ROSA et al., 2016). Para comparar o grau de repelência dos diversos tratamentos, utilizou-se a Eq. (1), onde se estabelece um Índice de Preferência indicado por Procópio et al. (2003): I.P. = % de insetos no teste - % de insetos na testemunha (1) % de insetos no teste + % de insetos na testemunha Em que: I.P.: -1,00 a -0,10 = Teste repelente; I.P.: -0,10 a +0,10 = Teste neutra; I.P.: +0,10 a +1,00 = Teste atraente. As análises estatísticas de comparação entre os percentuais de insetos presentes no tratamento foram feitas por ANOVA seguida de teste de Tukey com 95% de confiança com auxílio do software SPSS student version e a correlação de Pearson entre as doses e os índices de preferência, no Excel.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Avaliação do efeito inseticida do óleo essencial de C. cassia

O óleo essencial de C. cassia possui efeito inseticida nas doses testadas sobre S. zeamais, apresentando valores em torno de 22,5% de mortalidade com a dose de 10μL e 100% de mortalidade na dosagem de 120μL, conforme observa-se na Figura 7.

A Tabela 1 apresenta a análise estatística de comparação das médias de mortalidade do S. zeamais com as doses testadas de óleo essencial de C. cassia. Observa-se que as doses de 120µL/placa, apresenta uma média de mortalidade de 100%, diferindo a nível de 5% quando comparadas com as outras doses. Assim, uma dose de 120 µL/placa (0,78 µL/cm2 ) é suficiente para se obter uma alta eficiência no controle de S. zeamais em condições experimentais.

Ribeiro et al. (2020), avaliando o efeito inseticida de Croton rudolphianus sobre S. zeamais encontraram resultados semelhantes com 100% de mortalidade em 125 μL/g de óleo essencial.Observando-se o efeito de C. cassia sobre S. zeamais nota-se um resultado crescente de acordo com as dosagens aplicadas. Destacando-se ação inseticida relevante do óleo essencial utilizado.

5.2 Avaliação do efeito de repelência do óleo essencial de C. cassia em arenas

A Tabela 2 mostra a análise estatística com a comparação média de porcentagem dos insetos no tratamento com óleo essencial no teste de repelência. Observa-se que as doses de 6,88 e 26,52 µL/placa, sendo elas, DL15 e DL30, com uma porcentagem de insetos no tratamento de 14,67% e 10,67%, onde as mesmas não se diferem estatisticamente usando a comparação de média pelo Teste de Tukey (p>0,05), com diferença apenas entre a maior e menor dose testada. Observa-se também que ocorre uma diminuição do percentual de insetos com o aumento das doses, sendo que 0,04 µL/cm2 foi de 14,67% e a 0,34 µL/cm2 foi de 4,0%.

A dose de 0,34 µL/cm2 (52,86 µL/placa), a DL50, proporcionou o maior I.P. que foi de - 0,9 indicando que esta dose têm a maior ação de repelência sobre os S. zeamais. As demais doses 0,17 µL/cm2 (26,52 µL/placa) e 0,04 µL/cm2 (6,88 µL/placa) tiveram ação de repelências, mas menores comparados com a de maior dose testada, no qual o I.P. das mesmas foi de -0,7 e -0,6, respectivamente DL30 e DL15. A correlação entre as concentrações testadas e os respectivos índices de preferência foi de 0,994, comprovando que o aumento de concentração do óleo essencial induz a um aumento da repelência de S. zeamais em grãos de milho armazenados. A Tabela 4 mostra a análise estatística com a comparação média de porcentagem dos insetos no tratamento com óleo essencial no teste de repelência em mini silos. Observa-se que as doses de 5000 e 6000 µL/silo, com uma porcentagem de insetos no tratamento de 59%, onde as mesmas não se diferem estatisticamente usando a comparação de média pelo Teste de Tukey (p>0,05), com diferença apenas entre a maior e menor dose testada. Observa-se também que ocorre uma diminuição do percentual de insetos com o aumento das doses, sendo que 31,45 µL/cm3 foi de 8,5% e a 94,34µL/cm3 foi de 97,5% de mortalidade.

A curva de mortalidade de S. zeamais em função da dose de óleo essencial de C. cassia é apresentada na Figura 8, a qual destaca-se com um R 2 de 0,939. Com a equação da reta determinou-se a DL50, DL30 de C. cassia sobre S. zeamais onde gerou uma DL50 de 1582 μL/silo (16,58 µL/cm3 ) e uma DL30 de 156,43 μL/silo (1,64 µL/cm3 ). Observa-se a partir dos dados obtidos para DL50, que é necessária uma dose letal baixa para obter-se a mortalidade de S. zeamais.

Os índices de preferência nos testes realizados com S. zeamais estão apresentados na Tabela 5 que se mostraram repelentes em todas as dosagens testadas, variaram entre -1 com 1582μL (DL50), –0,8 com 156,73μL (DL30). Foi observada correlação (Pearson = 0,99) entre as diferentes doses testadas e os respectivos índices de preferência.

A correlação entre as concentrações testadas e os respectivos índices de preferência, confirmam que o aumento de concentração do óleo essencial induz a um aumento da repelência de S. zeamais em grãos de milho armazenados, e que uma dose equivalente a DL30 de C. cassia sobre S. zeamais é suficiente para sinduzir a repelência dos insetos via fumigação dos grãos armazenados.

5.3 Atividade antifúngica do óleo essencial comercial de C. cassia

Os resultados da atividade antifúngica do óleo essencial de C. Cassia sobre os três fungos testados estão apresentados na Tabela 6.

O óleo essencial de C. cassia apresentou o valor de halo de inibição de 30 mm para A. alternata e P. crustosum e de 29 mm para A. flavus na maior concentração testada (10%)

Para o óleo essencial, a CIM, concentração necessária para formar um halo de inibição igual ou maior a 10 mm de diâmetro, para os três fungos testados foi de 0,5%. Com base nos resultados da CIM o fungo mais sensível foi A. alternata, seguido de P. crustosum e A. flavus foi o micro-organismo mais resistente, formando o menor halo de inibição (11 mm) na concentração de 0,5%. Wang et al. (2018), avaliaram a atividade antifúngica de 11 óleos essenciais sobre três fungos toxigênicos, A.flavus, A. carbonarius e P. viridicatum, através da determinação do diâmetro da zona fúngica, entre eles o óleo essencial de C. cassia, e verificaram que este estava entre os 4 óleos essenciais com maior atividade antifúngica. Além disso, os autores realizaram experimentos com seis dos principais componentes ativos encontrados em óleos essenciais, incluindo trans-cinamaldeído, e os resultados indicaram que este composto, pode contribuir para o efeito antifúngico. Xie et al. (2017), investigaram as atividades antifúngicas de óleos essenciais da casca da espécie Lauraceae, do broto do cravo, do cinamaldeído e de derivados do eugenol contra os fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani e Fusarium oxysporum, e observaram inibição do crescimento micelial provocado pelos dois óleos essenciais. Segundo os mesmos autores, as características estruturais dos compostos presentes nos óleos essencial pode ter relação com a atividade, para os derivados do cinamaldeído a atividade antifúngica pode estar relacionada à ligação dupla conjugada e ao comprimento da cadeia CH ligada ao anel, outro fator que pode ter influência é a lipofilicidade do composto.

6. CONCLUSÃO

Comprovou-se que C. cassia possui ação inseticida em todas as dosagens testadas ao longo do tempo e que em 24 horas de exposição nas dosagens mais altas testadas já foi o suficiente para a morte dos insetos presentes nos grãos. Com base nos resultados obtidos neste trabalho evidenciou-se que o óleo essencial de C. cassia mostrou repelência sobre S. zeamais no bioensaio com arenas. Em relação à ação repelente constatou-se que o óleo essencial de C. cássia apresentou repelência sobre S. zeamais no bioensaio com mini silos, indicando a ação de repelência em todas as doses letais testadas, com correlação positiva entre as doses avaliadas e o aumento da repelência. No teste antifúngico, pode-se considerar o óleo essencial de C. cássia uma alternativa no controle do desenvolvimento de fungos filamentosos. O óleo essencial de C. cassia

apresentou-se como potencial agente para redução de perdas causadas por fungos em grãos de milho armazenados e, principalmente para a redução da incidência de micotoxinas nestes. Levando em consideração ao aspecto ecológico deste trabalho, obteve-se resultados promissores, indicando que os agricultores poderão deixar de usar inseticidas industriais prejudiciais ao meio ambiente e ao responsável pela aplicação desses produtos, substituindo-os por especiarias pertencentes ao ambiente. Ressalta-se que a planta libera através do contato com o oxigênio, alguns de seus componentes químicos quando colocada em meio aos grãos de milho e em ambiente fechado, repelindo os insetos. Possibilitando assim, uma forma de visar lucros e não necessitando somente do óleo para repelir os insetos. Considerando a possibilidade de que insetos podem adquirir resistência contra princípios ativos de diferentes origens, o estudo dos óleos essenciais pode ser alternativa aos novos bioprodutos usados diretamente no controle de insetos ou mesmo, novos modelos moleculares para a produção de pesticidas menos agressivos para o ambiente. Recomenda-se o uso do óleo essencial de C. cassia em grãos armazenados, porém são necessários estudos complementares, visando oferecer ao usuário um produto eficiente, de baixo custo e seguro do ponto de vista toxicológico.

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